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细菌学常用染色技术

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发表于 2022-1-14 15:48:00 | 显示全部楼层 |阅读模式
实验四细菌学常用染色技术

一、实验目的:

1、掌握油镜的使用技术;

2、学会细菌的简单染色法,革兰氏染色法,芽孢,荚膜染色法。

二、实验原理

1、油镜的基本原理:通过在载玻片上加一滴香柏油提高分辨率。

2、简单染色法的原理:简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。常用碱性染料进行简单染色,这是因为:在中性、碱性或弱酸性溶液中,细菌细胞通常带负电荷,而碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷,因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

3、革兰氏染色法的原理:G+菌与G-菌时由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的,G-菌的细胞壁类脂多,而肽聚糖薄,细菌易被脱色,经复染后染成红色,而G+菌肽聚糖较厚经脱色后细菌仍为初染后的紫色。

4、芽孢染色法的原理:用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红,在加热条件下染色,使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内,进入菌体的染料经水洗后被脱色,而芽孢一经着色难以被水洗脱,当用对比度大的复染剂染色后,芽孢仍保留初染剂的颜色,而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色,使芽孢和菌体更易于区分。

5、荚膜染色法的原理:由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色;而且可溶于水,易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法(负染)染色,使菌体和背景着色,而荚膜不着色,在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水量高,制片时通常不用热固定,以免变形影响观察。

三、实验器材:

1、菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、圆褐固氮菌

2、仪器材料:显微镜、载玻片、盖玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、试管、接种环

3、染色液:草酸铵结晶紫染色液、路哥尔氏碘液、95%乙醇、0.5%番红染液、5%孔雀绿染液、黑色素

四、实验内容步骤:

1、革兰氏染色法:

①涂片:滴一滴无菌水到载玻片上,用接种环在酒精灯此案各挑取一环金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,均匀涂于载玻片上

②固定:涂片在火焰上方干燥(不烫手为宜)

③染色:加草酸结晶紫染液染2min,用水冲洗,滴加路哥式碘液1min,水洗,滴加95%乙醇,紫色去除后用水洗去,滴加番红染液2min,用吸水纸吸干。

④镜检:用油镜观察。

2、芽孢染色法:

①制备菌液:加一滴水于小试管,用接种环取2-3环枯草芽孢杆菌到小试管中打匀,制成浓稠菌液。

②加3滴5%孔雀绿染色液三滴,试管沸水浴加热20min

③涂片:用接种环取菌液涂于载玻片上

④固定:用火焰将菌液干燥

⑤脱色:水洗脱色,水中无孔雀绿为止

⑥复染:加番红染液3min,去染色液,用吸水纸吸干

⑦镜检

3、荚膜染色法:

①制菌液:滴一滴黑色素于洁净的玻片上,挑取圆褐固氮菌与其混匀

②加盖玻片并在油镜下观察

五、报告要求

1、绘图并说明大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形状、颜色和革兰氏染色反应。

2、绘图表示枯草芽孢杆菌的形态,注意芽孢的形状、位置及芽孢囊的形状特征。

3、绘图表示圆褐固氮菌菌体和荚膜的形态。

实验结果分析:

1.革兰氏染色中,对三区分配不太明显,最开始的两滴水的距离较近。还有可能使在染色和洗片的过程中,将一端的菌样冲到另一边,使两菌样混合。最终的染色效果不错,能良好的区分革兰氏阴性和阳性菌。

2.对芽孢的染色中实验结果很好,能清楚地观察到芽孢和菌体的不同颜色和位置。

3.对圆褐固氮菌荚膜的染色中,菌体的黑色不明显,似乎整个细菌都是透明的,效果不是很好。里面有气泡。

思考题

1、使用油镜应特别注意什么?为什么要求制片完全干燥以后才可以使用油镜观察?

答:①应先用低倍镜下找到物象,再转换为油镜;②加香柏油时切勿加多,下降镜筒使油镜浸入香柏油中;

③各个镜面切忌用手涂抹,以免手上的油、汗沾于镜面,否则日后易发霉,腐蚀;④用二甲苯擦镜头时,用量要少,不宜久抹,以防胶粘透镜的树脂被溶解;⑤油镜工作距离甚短,故操作时要特别谨慎,切忌用眼睛对这目镜边观察边下降镜筒,由于直接在玻片上滴加香柏油,当制片时未完全干燥时,水与香柏油不互溶,影响观察。

2、革兰氏染色中,那一步可以去除而不影响最终结果?为什么?

答:复染这一步可以去除而不影响最终结果,因为G+菌肽聚糖较厚,交联度高,类脂含量少,脱色后仍保持原初染的紫色,而G-菌肽聚糖薄,脱色后原有颜色失去,若不经过复染则保持无色,因此去除复染后,紫色为G+菌,无色或无法染色为G-菌。

3、如果涂片中观察到大量游离芽孢,很少看到芽孢囊及营养细胞,你认为是什么原因?

答:a.由于芽孢的壁厚,耐压力比细胞体强。因此有可能是由于在图片是用力过大,将细胞体的细胞壁压碎,从而使芽孢脱落出来的缘故。b.也有可能是由于菌体培养时间过久,芽胞正处于复苏阶段,所以大多芽孢都从饱囊中游离出来。
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